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2024-06-20 17:04 來源：
抗體純化工藝解決方案——ProteinA親和層析
一、抗體下游工藝流程的概況
近些年單抗市場發展迅速，從2008至2022年，全球生物制品市場份額從17%增長至30%，大約50%生物制品銷售額來自于抗體及其Fc融合蛋白。近些年，中國單抗藥物市場呈爆發性增長趨勢，2022年銷售額已達1100億，預計2023年將突破1500億，而國產單抗藥物也陸續實現突破，近些年不斷有新的單抗藥物上市。
但在單抗快速發展的同時，制藥企業也面臨著新的挑戰。首先是降低生產成本，由于熱門靶點有限，可能同一款單抗藥物有多個公司在同時研發藥物，制藥公司面臨著激烈的市場競爭，同時由于國家4+7帶量采購的政策的發布，迫使藥企迫切追求降低生產成本。其次是提高生產效率，除部分熱門靶點藥物外，大部分靶點藥物市場需求量小。最后是產品質量控制，隨著中國加入ICH，和國際藥品監管體系接軌，對藥品質量和生產過程有了越來越嚴格的要求。
二、蛋白A親和層析工藝流程
目前單抗在純化階段多采用三步層析純化策略，ProteinA親和層析因為其高特異性，成為第一步粗純的首選。
ProteinA是一種分離自金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白，通過Fc片段結合哺乳動物IgG。天然的ProteinA不穩定，將其改造后獲得的ProteinA不僅穩定性更好，而且對Fc片段的結合能力更強，非特異性結合更弱。將這種蛋白結合到微球上，便獲得了一種能夠特異性結合抗體蛋白的層新填料。SpreX ProA系列產品中結合的PeoteinA蛋白是經過改造后的蛋白，可耐受高達0.5M NaOH，實現在使用結束后對填料更加徹底的清潔消毒。
以等電點在8左右的抗體蛋白為例，一般的粗純流程如下：
培養收獲液經澄清過濾或離心分離后去除大的細胞和細胞碎片，再用0.45/0.22um的濾膜過濾，以使樣品能夠順利通過而不至于堵塞層析柱，隨后便可將進行Pro A親和層析。層析中用到的所有緩沖液也都要用0.45/0.22um的濾膜過濾，盡可能減少不溶性微粒，并降低微生物以減少使用過程中填料的損傷。典型的ProA親和層析步驟包括：
消毒→平衡→上樣→再平衡→洗雜→平衡→洗脫→清潔→平衡→消毒→平衡
第一步的消毒是為了清洗雜質，排除上一次使用對本次層析的干擾，一般為0.1M NaOH，淋洗2CV后暫停15min。NaOH清洗填料的同時也會對填料造成不可逆的損傷，使用更加耐堿的SpreX ProA系列填料可使填料使用壽命更長。
第二步平衡是為了洗去NaOH,并將層析柱中的pH、電導等替換為與樣品接近的環境，使樣品結合更加穩定。建議使用和澄清過濾時相同的平衡緩沖液，并平衡至pH、電導與平衡液相同。
第三步上樣即為將樣品流過層析柱。在該過程中，應選擇合適的樣品保留時間以使目的蛋白有充足的時間和填料中的ProteinA結合，通常建議保留時間4-6min，未結合的雜質流穿。同時，由于培養樣品一般粘度較高，上樣過程可能會有較大反壓，應時刻注意壓力，保證在不超過最大壓力限制下上樣，此限制的優先級應高于保留時間對流速的要求。如壓力過大流速過低，解決方法可考慮通過一些手段先降低樣品粘性，或考慮使用粒徑更大的填料。
第四步再平衡是使用與上樣前平衡時相同緩沖液將上樣結束后層析柱中還未流穿的雜質頂洗出來。由于此過程中層析柱里仍然是樣品，還會有較大反壓，建議在第一個CV時使用同上樣時相同的流速，隨著樣品雜質流穿后續可選擇使用更高流速，并直到pH、cond、uv280曲線平穩，一般需要5cv左右。
第五步洗雜主要洗去填料上非特異性結合的雜質，一般使用pH5.5的緩沖液，并加入添加劑如氯化鈉、尿素等，通過高鹽來洗去雜質，洗去的雜質主要包括HCP、DNA等。HCP結合在填料上的相互作用中 HCP與單抗之間的相互作用占主要部分，在酸性pH下抗體一般為中性或帶正電荷，而HCP大都為中性或帶負電荷，從而兩者之間容易形成疏水結合或者離子結合，通過中間pH和添加劑的緩沖液淋洗可以洗去一部分HCP雜質。此外，由于不同添加劑作用不同，可以根據實際情況選擇合適的添加劑，目前氯化鈉是最常用的，但尿素、精氨酸等由于其不同的除雜機制，也被越來越多的使用。
第六步平衡為pH5.5的洗雜時未加入添加劑的緩沖液，目的是將柱子內緩沖液替換為低鹽條件，以防止洗雜緩沖液中加入的添加劑進入洗脫樣品中，對蛋白穩定性造成不利影響，同時也能洗去部分因疏水作用結合的HCP。
第七步洗脫一般使用pH3.5左右的與上一步平衡時相同緩沖體系的緩沖液，利用低pH將目的蛋白洗脫，并在收集口收集樣品。若有相關需求，可在此時進行低pH病毒滅活，若無相關需求，可直接用1M Tris-HCl，pH9.0調pH至蛋白穩定的范圍，一般為5.5。回調過程中會出現沉淀，一般是HCP和核酸，也會有少量單抗聚集。再經過深層過濾除去沉淀后HCP和核酸通常可降低至100ppm以下。有研究指出，在低pH下抗體蛋白會將疏水中心暴露出來從而導致聚集，而更加緩慢的調節pH，給蛋白更多的結構變化時間能夠有效降低單抗的聚集。此外，也可以在洗脫緩沖液中加入適量氯化鈉從而可以在更加溫和的pH下將蛋白質洗脫，或者加入適量乙二醇以減弱分子間疏水作用減少聚體的形成。
第八步清洗，一般使用1M HAc或0.1M Critic acid，目的是使用更低的pH將填料上未洗脫的其他雜質洗脫下來。清洗的溶液pH建議大于2，以減少填料的損傷。如果仍然無法清洗干凈，可嘗試使用鹽酸胍、異丙醇清洗。
第九步平衡是為了在第九步的氫氧化鈉消毒前有一個緩沖，否則酸堿直接中和會對填料有較大損傷。
第十步消毒，目的是利用0.1M NaOH的高pH將填料上的脂蛋白、脂質和核酸洗脫，同時對填料進行殺菌消毒，滅活細菌、病毒和內毒素。
第十一步平衡，是為了將NaOH清洗干凈，防止對填料造成損傷。若無后續實驗，則可將填料保存于20%乙醇中。
三、親和層析工藝優化
樣品經過一步層析后一般單體純度可達95%以上，收率為90%左右，主要雜質為聚體、電荷異質體、HCP、DNA和ProteinA。其中聚體和電荷異質體等在親和層析階段優化空間不大，另一方面是這些雜質在后續離子層析階段可以去除，因此一般不作為親和層析工藝優化關鍵點。Protein A是由于填料配基脫落所導致，一般只需維持在較低水平即可，而且也可以在離子層析階段去除，但其含量可作為填料自身性能變化的參考。因此，親和層析階段的工藝參數優化應重點關注收率、HCP、DNA和ProteinA.
樣品收率與樣品上樣載量密切相關。高流速、高載量是目前親和層析填料發展的趨勢，選擇更高載量的填料以及合適的實際上樣載量能夠獲得更高的收率，同時降低生產成本。毫厘科技的SpreX ProA D80能夠在4min保留時間下達到60 mg hIgG/mL以上的動態載量，其平均粒徑為80un，能夠實現0.2MPa下500cm/h的流速，讓生產過程更加高效。SpreX ProA H60則粒徑更小，載量更高，為工藝開發帶來更多選擇。填料的高動態載量還應結合實際的工藝參數，過高或過低的上樣載量都會導致收率降低，因此從低載量填料更換為高載量填料，還應進行對應的工藝優化實驗。隨著親和層析填料使用次數的增加，其微球表面附著的雜質也會越來越多并降低目標蛋白的載量。此外洗脫pH、收集峰位置也會影響收率，高的洗脫pH和窄的收集峰會降低收率，但可以提高產品質量；低的pH和寬的收集峰會提高收率，但會使產品質量降低。工藝條件的優化目標是在質量和收率之間的平衡，即在保證質量的情況下盡可能提高收率。
目前抗體蛋白主要采用真核細胞胞外表達，HCP和DNA會在培養末期或離心過程中細胞死亡后釋放出來，通常在親和層析前其含量可能高達幾十萬甚至上百萬ppm，而在親和層析后則下降到幾百ppm。HCP和DNA在pH5.5左右時一般帶負電荷，可回調pH后通過深層過濾去除，若對質量有更高要求也可通過陰離子層析去除，同時陰離子層析還能去除核酸和病毒，且由于單抗的陰離子層析通常是流穿模式層析，工藝相對簡單，被普遍應用于單抗的純化。
親和后樣品中含有的ProteinA一般來源于親和填料配基的脫落，其一方面作為產品雜質應當被控制，另一方面也可作為填料配基脫落程度的參考。使用SpreX ProA系列填料進行親和層析，Protein A的含量可保持在10ppm以下。一般對填料配基脫落影響最大的因素是CIP階段的氫氧化鈉清洗。為了洗去填料上未洗脫的脂蛋白，滅活內毒素以及控制微生物限度，一般會在層析前和層析后使用0.1M NaOH進行15min左右的消毒，這對親和層析填料來說是必須的，但會極大影響配基的穩定性，SpreX ProA系列填料使用經改良的Protein A配基，能夠耐受0.5M NaOH，增加在0.1 M NaOH下的使用壽命。
以當前純化工藝發展情況，親和層析填料通常占據所有層析填料成本50%左右，在當下制藥行業整體降本增效的背景下，國產化已成為趨勢。毫厘科技全球領先的微流控微液滴成球技術過程可控，并且能夠制造出粒徑更加均一的微球，使用SpreX ProA系列填料將可能在樣品收集階段的分辨率、收集體積帶來更好的表現，從而降低后續純化階段生產成本。
四、填料動態載量測試
填料動態載量測試一般是在上樣載量優化或填料壽命驗證中進行。使用純化后的目標蛋白測試不經過層析柱時的uv值，隨后上樣直至有樣品流穿并且uv值達到10%流穿時的uv值，記錄上樣體積并計算填料載量。在親和層析工藝優化時，通常樣品上樣載量定為動態載量的80%左右。在親和層析填料壽命驗證階段，當動態載量出現明顯下降時的使用次數定為壽命終點。
五、親和層析中的ProteinA的替代品
為了滿足高性價比產品的巨大需求，同時滿足嚴格的質量標準，對生產策略進行了必要改進，人們設計并研究了蛋白A的替代配體。蛋白質G和蛋白質L是已知的與蛋白質A功能相似的配體。蛋白質G由一個多肽組成，多個結合域以圓柱形連接 ;蛋白G由1個具有多個結合域的單肽組成，來源于 G群和C群鏈球菌。然而，ProteinG比ProteinA沒有太大的優勢，最重要的限制是洗脫的pH太低，非特異性行為升高，聚集體含量高，穩定性下降，綜合成本甚至高于ProteinA 樹脂。ProteinL也是由鏈球菌表達，會與包含特定kappa輕鏈的抗體特異性結合，由于其高特異性，蛋白L在單抗純化過程中尚未取代ProteinA。
ProteinA并不能結合所有IgG，而且有的抗體蛋白中并不含有Fc段，因此會有基于ProteinL或其他親和配體的親和層析。但這些產品仍需在載量、穩定性等方面繼續改進才能使性能超過基于ProteinA的親和層析。
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