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行業法規純化工藝介質維護經典文獻案例分享

抗體蛋白純化解決方案——離子層析

2024-02-26 09:54 來源：毫厘科技

抗體純化解決方案——離子層析

離子層析是應用最廣泛的一種層析方法，在單抗純化工藝中主要作為精細純化的手段。在單抗發酵過程中，細胞培養液通常為中性pH環境，表達出的抗體經細胞分泌后，即帶有正電荷。如果抗體在生產工藝中，反復跨越等電點，會增加其聚集、沉淀、產生變體和失活的風險，不僅為后續純化過程增加了難度，同時也會降低整體收率，增加生產成本。所以在后續工藝中合理的控制實驗條件，維持單抗帶正電荷的特性，有助于工藝的開發，當然，根據不同的單抗性質，也要做出合理的調整。對于帶正電荷的單抗分子，在陽離子層析純化過程中，采用結合洗脫模式；在陰離子層析過程中，使用流穿模式層析，不同的層析模式在抗體純化中的作用也不相同。 20220512-毫厘科技logo的副本-03.png

一個經典的單抗純化三步法工藝方法如下：

單抗經SpreX ProA D80/H60親和層析、低pH病毒滅活和深層過濾后，此時主要雜質包括HCP、HCD、聚體、電荷異質體以及微量親和層析填料脫落的Protein A配基等，而去除這些雜質實現進一步精純，主要利用雜質與抗體在帶電性上的差異，通過離子交換層析實現分離。

陰離子層析

在陰離子層析階段能夠對蛋白進行進一步的精純，去除的雜質包括HCP、HCD、病毒、內毒素和ProteinA等，這些雜質能夠被陰離子交換層析介質吸附，而帶有正電荷的抗體分子則流穿。在此階段，對介質分辨率要求不高，更加考驗介質的綜合性能，建議使用高流速高耐壓的陰離子層析介質SpreX Q等。

除了以上雜質外，陰離子層析的除病毒效果在單抗純化中也十分重要。單抗的培養表達使用的真核細胞可能成為污染源，單抗的給藥方式是靜脈注射，抗體藥物的申報中也對除病毒效果以及最終產品中病毒含量也有著嚴格的要求，因此單抗藥物純化過程中的除病毒效果是必須考慮的問題。雖然ProA親和層析、低pH病毒滅活、除病毒過濾等都有一定的除病毒效果，但是通常都需要加入陰離子的除病毒作用才能使總體的病毒去除率有所保證。因此，單抗純化的工藝中陰離子具有十分重要的地位。

以某阿達木單抗的純化為例，該蛋白等電點為8.3，在pH5.3-6.5時具有較好的穩定性，同時在pH5.7條件下進行陽離子層析能夠較好的去除電荷異質體，陰離子層析則在較寬的pH范圍內都具有比較好的除雜效果。為了減少不必要的操作步驟，最終選擇在pH5.7的條件下進行陰離子離子層析，其完整的層析流程包括以下階段：

陽離子層析

陽離子層析的一個重要作用是能夠去除電荷異質體。蛋白表面一般都含有大量的帶電荷基團，抗體分子翻譯后修飾或降解的發生導致其等電點或空間電荷分布等表面電荷特性發生改變，從而導致了電荷異質體的產生。根據蛋白所帶凈電荷的不同，可以根據基于電荷的純化方法將蛋白分為酸性電荷異質體、中性主成分和堿性電荷異質體。酸性和堿性電荷異質體與中性主成分在臨床效果通常會有差異，所以在純化階段需要對各種電荷異質體的雜質進行去除。

當最終純化工藝采用陽離子交換層析時，料液已經過多次純化，原液成本高昂；且分離電荷異質體和聚體等雜質需要介質具有更高的分辨率，推薦使用粒徑較小、分辨率高、載量高、耐壓高的SpreX S D40進行層析，毫厘科技基于全球領先的微流控微液滴成球技術，對層析介質生產過程的可控性更強，能夠生產出粒徑高度均一的介質產品，在分辨率上帶來更多的驚喜。

以前文陰離子層析中的單抗純化為例，在陰離子層析后使用陽離子層析去除電荷異質體，完整的陽離子層析過程如下：

陽離子層析除了對電荷異質體有良好的去除效果外，對聚體和病毒也都有一定的去除效果。

由于聚體比單體的結合能力更強，也能通過離子結合能力強弱進行分離，但兩者之間的分辨率較差。推薦的做法是選擇合適的洗脫液后設定一個比較高的收集結束峰值，因為一般收集峰的尾部聚體含量比較高。但過高的收集結束峰值又會導致收率降低，因此也需要進行一定研究后得到一個合適的峰值。

陽離子的除病毒能力相比于陰離子較弱，一般能達到1-3log₁₀ ，而陰離子則能夠達到5-7log₁₀，因此陽離子的除病毒效果一般只作為一個補充。有研究數據顯示，在一定條件下，陽離子層析可實現MuLv、PRV和Reo-3的＞4log10的病毒清除率，這與層析的pH條件相關。但在所有pH條件下，MMV的清除率都不高。MuLv的pI為5.8，MMV的pI為6.2，由此可推測，陽離子層析的病毒清除機制并非單純的電荷作用。

總結

本文基于目前對單抗純化的一些行業經驗，結合國內外一些研究，以及部分具體案例，總結了離子層析在單抗純化中的部分應用。文中的單抗純化只針對大多數情況，另有少部分等電點差別較大或是前期處理方法不同的單抗純化項目，毫厘科技也能提供其它種類的層析填料如SpreX Q D40、SpreX S、SpreX MMA、SpreX MMC、SpreX MMC D40等滿足您的需求。